Überwachung der Gesundheit der festen Organe nach Versetzung unter Verwendung zellfreier DNA

Die Diagnosen, die auf cfDNA basierten, konnten Gewebebiopsie veraltet machen
Teure und Invasionsgewebebiopsien, zum von Allograftablehnung nach Versetzung zu ermitteln, zahlreiche Beschränkungen zu haben. Die Proben, die auf zellfreier DNA (cfDNA) basierten — verteilende Fragmente von DNA gaben von den Zellen, Gewebe frei, und Organe, wie sie natürliche Zelle durchmachen, Tod-sind intensiv vor kurzem studiert worden und konnten unsere Fähigkeit schließlich verbessern, Ablehnung zu ermitteln, ändert Werkzeug früher im Management und erhöht sogar das langfristige Überleben von verpflanzten Organen.
CfDNA-Proben, die den Bedarf am Ganzgenom umgehen, das (WGS) der Reihe nach ordnet und den Bedarf am a priori Wissen von Spender- und/oder aufnahmefähigen Genotypen, haben starke logistische Vorteile und sind z.Z. unter klinischer genauer Untersuchung. Darüber hinaus hat das Verbessern des Wissens der Organ-spezifischen Kinetik von Spender-abgeleiteter cfDNA (DD-cfDNA) folgender Versetzung auch geholfen, diese Proben zu optimieren. Labors auch haben alternative Methoden für die Quantitativbestimmung von DD-cfDNA, wie digitale Tröpfchenpolymerase-kettenreaktion (PCR) und Organ-spezifische DNA-Methylierungsmuster vorgestellt. Als solches ist das Feld von den minimal Invasionsdiagnosen, die nach cfDNA basiert werden, in zunehmendem Maße viel versprechend, ein Tag traditionelle Gewebebiopsien möglicherweise ersetzend.
DIE ROLLE VON CFDNA IN DER ORGAN-ABLEHNUNG
Die Ablehnung, auf Verletzung eines gespendeten Organs beziehend, das durch das Immunsystem der Empfängers verursacht wird, kann Allograftfunktionsstörung und sogar geduldigen Tod verursachen. T-cell vermittelte akute zelluläre Ablehnung (ACR) tritt häufig innerhalb der ersten 6 Monate der Nachtransplantation (1) auf. ACR bezieht Ansammlung von CD4+- und CD8+-T-Zellen in den zwischenräumlichen Raum des Allograft mit ein, während das Immunsystem der Empfängers Antigene auf dem gespendeten Organ erkennt, wie fremd. Diese T-Zellen leiten eine immune Kaskade ein, die schließlich zu programmierten Zelltod (Apoptosis) der gerichteten Zellen führt. Während diese Zellen sterben, wird genomische DNA zerspaltet und die Fragmente von DD-cfDNA, ungefähr 140 niedrige Paare (bp) in der Länge messend, werden freigegeben, um das Pool des aufnahmefähigen cfDNA im Blut zu verbinden und ausgeschieden schließlich im Urin (2).
Verteilendes cfDNA ist vor kurzem als Diagnose-Tool wirksam eingesetzt worden, um Invasionsbiopsien in anderen Bereichen von Medizin, einschließlich das Analysieren von fötalen DNA-Fragmenten innerhalb der mütterlichen Zirkulation, um genetische Anomalien in utero zu identifizieren und das Der Reihe nach ordnen verteilender DNA zu ersetzen, die von den Tumorzellen freigegeben wird, um Krebs-bedingte Veränderungen zu identifizieren. In beiden diesen Fällen sowie in der Versetzung, unterscheidet das Hochdurchsatzder reihe nach ordnen, das DNA-Sequenz-Unterschiede identifiziert und quantitativ bestimmt, zwischen den zwei verschiedenen Bevölkerungen von cfDNA abgeleitet von den eindeutigen Quellen (2). Drei Eigenschaften von cfDNA lassen es einen ausgezeichneten nichtinvasiven Kandidatenbiomarker Ablehnung nach fester Organtransplantation ermitteln: Sie kann von einem einfachen Blutabgehobenen betrag, von seiner Konzentration, die genau gemessen werden, und von seiner leicht identifizierten Nukleotidreihenfolge erreicht werden. Unter Verwendung des cfDNA als Biomarker für ACR ist auch günstig, da es von den verletzten Zellen des gespendeten Organs abgeleitet wird und ein direktes Maß Zelltod deshalb darstellen sollte auftretend im Allograft. Außerdem behält erlaubt cfDNA alle genetischen Eigenschaften der ursprünglichen genomischen DNA bei und das Genmaterial, das vom gespendeten freigegeben wird vom cfDNA unterschieden zu werden Organ, das von den Zellen der Empfängers abgeleitet wird, die natürlichen Apoptosis (3) durchmachen.
Häufige und genaue Überwachung der Allograftgesundheit ist für das langfristige Überleben der Transplantationsempfänger wesentlich. Für Herzversetzung (HT), ist endomyocardial Biopsie (EMB) der gegenwärtige Goldstandard für die Entdeckung von ACR (4). Jedoch sind EMBs mit bedeutenden Beschränkungen teuer, von denen viele für alles Organ biopsiert allgemein sind (5-7). Außerdem setzt die Invasionsnatur von EMBs HT-Risikopatienten für Komplikationen (6,8,9).
Leider zur Zeit verfügbare nichtinvasive Methoden einschließlich Echokardiografie oder genügende Besonderheit magnetischen Resonanz- Darstellung (MRI)-Mangels und Empfindlichkeit, zum der Ablehnung (10-13) zuverlässig zu ermitteln. Blut-ansässige Biomarkers, wie cfDNA, stellen eine viel versprechende Alternative dar, die in klinische Praxis (14-17) bereitwillig eingeführt werden könnte.
KINETIK VON CFDNA WÄHREND DER RUHE UND DER ABLEHNUNG
Da cfDNA vom natürlich vorkommenden Prozess von Apoptosis entsteht, haben alle Einzelpersonen nachweisbare Niveaus von cfDNA in ihrem Blut (18). Für gesunde Einzelpersonen kommt die Mehrheit des verteilenden cfDNA von den hematopoietic Zellen, die den natürlichen Tod durchgemacht haben, der auf zellulärem Umsatz bezogen wird. Niveaus von cfDNA schwanken aus mehrfachen Gründen einschließlich Infektion, Chirurgie, Trauma oder sogar vollständige Übung (2,19). Deshalb erfordert das Entwickeln einer cfDNA-ansässigen Probe, um Ablehnung zu ermitteln das Festsetzen der erwarteten Kinetik der Freigabe DD-cfDNA in die Zirkulationsnachtransplantation der Empfängers. Diese Erwägung ist besonders wichtig, da die Freigabe im Laufe der Zeit der Nachtransplantation DD-cfDNA Organ-spezifisch ist (20-22).
Zum Beispiel bei 1 Tag-nach-HT ist das durchschnittliche Niveau von DD-cfDNA 3,8 ± 2,3% (20). Jedoch bis zum 7 Tagen ist das Niveau von DD-cfDNA schnell gesunken und bleibt durchweg niedrig (<1> demgegenüber, wurden Empfänger von bilateralen Lungentransplantationen gefunden, um einen durchschnittlichen Bruch DD-cfDNA von 26 ± 14% zu haben am ersten postoperativen Tag. Außerdem wurde die Reduzierung in DD-cfDNA durch Niveaus von DD-cfDNA gekennzeichnet, die schnell innerhalb der ersten Woche sanken, aber andererseits verlangsamt und geblieben im Allgemeinen bei 1%-3% (21). Jedoch ähnlich Herz- und Nierentransplantationen während einer Episode der akuten Ablehnung, erhöhte sich das Niveau von DD-cfDNA erheblich und kletterte auf einen Durchschnitt von 14%-15%.
Unterschiede bezüglich der Gewebemasse und der Rate des zellulären Umsatzes erklären diese Variabilität in den Niveaus der DD-cfDNA freigegebenen frühen Nachtransplantation und während der Ruhe. Zum Beispiel können Unterschiede, bezüglich Niveaus DD-cfDNA in den bewegungslosen bilateralen und Einzellungentransplantationen zu verteilen, durch den Unterschied bezüglich des zellulären Umsatzes an zweiter Stelle erklärt werden und 107 gegen 58 Zellen/sein, (21) beziehungsweise. Durch Kontrast in einem bewegungslosen verpflanzten Herzen, ist die zelluläre Umschlagsgeschwindigkeit nur 8 Zellen/an zweiter Stelle (21-23). So ist ein Verständnis der erwarteten Niveaus von DD-cfDNA verbunden mit einem gegebenen festen Organ wesentlich, Entwicklung von Organ-spezifischen Proben zu erleichtern, die Ablehnung ermitteln. Sobald die Kinetik von cfDNA Freigabe für ein bestimmtes Organ verstanden werden, existieren einige Methoden für die Quantitativbestimmung der relativen Menge von DD-cfDNA.
STRATEGIEN, ZUM DER EMPFÄNGERS GEGEN DONOR-DERIVED CFDNA ZU UNTERSCHEIDEN
Spender-Empfänger-Sex-Fehlanpassung
Für Organtransplantationen, in denen der Spender männlich ist und die Empfänger weiblich ist, können Labors diese Sexfehlanpassung wirksam einsetzen, um Niveaus DD-cfDNA aus dem Gesamt-Pool das cfDNA der Empfängers (17) zu berechnen. Forscher demonstrierten zuerst die Möglichkeit dieser Annäherung in den Urinproben, die von den weiblichen Nierentransplantationsempfängern genommen wurden, die eine Niere von den männlichen Spendern empfangen hatten und als sie Ablehnung demonstrierte erhöhte Niveaus von DD-cfDNA in ihrem Urin erfuhren, der speziell die Regionen enthielt, die auf dem Y-Chromosom (17) gefunden wurden. Obgleich diese Annäherung überzeugte Diagnose der Ablehnung im Allograft zulässt, ist Sexfehlanpassung zwischen dem Spender und der Empfänger verhältnismäßig selten und nicht allgemeinhin anwendbar.
Spender-Empfänger-DNA-Sequenz-Unterschiede
Eine Organtransplantation kann als eine Genomtransplantation auch angesehen werden, da die Zellen innerhalb eines verpflanzten Organs die genetischen Informationen seines Spenders enthalten. Als solches beruht das Konzept der Genomtransplantationsdynamik (GTD) auf dem Vorhandensein von genetischen Unterschieden zwischen dem Spender und der Empfänger an einem bestimmten Ort, der dann wirksam eingesetzt werden kann, um den Ursprung des verteilenden cfDNA (20-24) zu identifizieren. Ideal würde die Empfänger für eine einzelne Basis (zum Beispiel, AA) homozygot sein und am gleichen Ort würde der Spender für eine andere Basis homozygot sein (zum Beispiel, GG).
Die genetische Uneinheitlichkeit zwischen Einzelpersonen gegeben, können zehn Tausenden der möglicherweise informativen Orte über dem Genom unter Verwendung des Hochdurchsatzes verhört werden, der der Reihe nach ordnet, um DD-cfDNA vom aufnahmefähigen cfDNA (20,24) zu unterscheiden. Dieses Konzept wurde zuerst unter Verwendung der ein Bankkonto gehabten Proben von den Herzspendern veranschaulicht, um a priori Spendergenotypen für jede Spenderempfängerpaarung zu erreichen. Nachdem er cfDNA von jeder Empfänger extrahiert hatte und der Reihe nach geordnet hatte, war der Bruch von Spender-spezifischen Molekülen entschlossen. In den Proben, die während oder direkt vor eines Biopsie-erwiesenen Ablehnungsereignisses genommen wurden, wurde der Anteil der Spender-spezifischen einzelnen Nukleotidpolymorphien (SNPs) gefunden, von 3%-4% <1>(24) sich erhöht zu haben.
Diese frühe rückwirkende Studie ist jetzt voraussichtlich validiert worden. Erwachsene und pädiatrische Herz- und Lungentransplantationsempfänger wurden eingezogen und Genotypen für jede Spenderempfänger, die Paare durch WGS mit einem Durchschnitt von 53.423 informativen SNP-Markierungen erhalten wurden, identifizierten (20). Gesamt, war Früherkennung der akuten Ablehnung der von AlloMap, die erste Nahrung überlegen und mischt Verwaltung-anerkannte nichtinvasive Annäherung zur Entdeckung von ACR nach HT Drogen bei, der auf transcriptome Analyse (25) basierte.
Forschung auch hat gezeigt, dass WGS nicht nur Informationen über eine Transplantation aber auch das virome eines Patienten und Gesamtzustand der Immunsuppression liefert. Dieses stellt einen möglicherweise großen Vorteil dar, der durch andere Proben (26-28) unerreichbar ist.
Jedoch stellt WGS Herausforderungen gegenüber, die verhindern konnten, dass es routinemäßig in der klinischen Praxis eingeführt. Zum Beispiel während die genetischen Informationen einer Empfängers leicht eingeholt werden können, gilt dies nicht immer für einen Spender. Außerdem ist WGS teuer Zeit raubend, arbeitsintensiv, und.
Eine alternative Methode setzt eine Platte von genotyped polymorphem SNPs ein, das innerhalb des Pools des extrahierten cfDNA identifiziert wird, das dadurch den Bedarf am a priori Wissen des spezifischen Genotypus eines Spenders (29) beseitigt. Anders als Nieren- und Lebertransplantationen die häufig zwischen eng verwandten Einzelpersonen auftreten, sind die Spenderempfängerpaare für Herz und Lungentransplantationen gewöhnlich nicht in Verbindung stehend. GTD erfordert Genotypisierung der Transplantationsempfängers und -spenders. Jedoch in der Praxis sind Spendergenotypusinformationen häufig nicht verfügbar. Hier sprechen wir diese Frage an, indem wir einen Algorithmus entwickeln, der Niveaus DD-cfDNA in Ermangelung eines Spendergenotypus schätzt. Unser Algorithmus sagt Herz und Lunge Allograftablehnung mit einer Genauigkeit voraus, die herkömmlichem GTD ähnlich ist. Wir entwickelten außerdem den Algorithmus weiter, um eng verwandte Empfänger und Spender, ein Szenario zu behandeln, das im Knochenmark und in der Nierentransplantation allgemein ist. Wir zeigen, dass es möglich ist, DD-cfDNA bei Knochenmarktransplantationspatienten, die oder ohne Bezug sind, die Geschwister der Spender sind, unter Verwendung eines versteckten Markov Modells zu schätzen. Deshalb sind Algorithmen für Herz- und Lungentransplantationen entwickelt worden, die annehmen, dass der Genotypus des Spenders bei der gleichen Frequenz wie die breite Bevölkerung auftritt. Basiert auf diesen Frequenzen und Vergleich zum bekannten Genotypus der Empfängers, kann der Bruch von DD-cfDNA vom Gesamtpool von cfDNA zuverlässig geschätzt werden lokalisiert worden von der Plasmaprobe einer Empfängers.
Im Falle der Lungenversetzung wurde dieses Einzelgenommodell, als verglichen mit der Methodologie unter Verwendung der Spender- und aufnahmefähigen Genotypen, gefunden, um vergleichbare Brüche von DD-cfDNA zur Verfügung zu stellen. Jedoch als Forscher diesen gleichen Algorithmus an HT anwendeten, wurden die geschätzten Niveaus von DD-cfDNA nicht so stark wie in den Lungentransplantationen aufeinander bezogen. Dieses hinge möglicherweise mit den niedrigeren absoluten Mengen von DD-cfDNA vorhanden nach HT zusammen. Dieses ist ein anderes Beispiel Organ-spezifischer cfDNA Kinetik, die Probenergebnisse beeinflussen kann und berücksichtigt werden muss (30).
Im Falle der Nierenversetzung sind zukünftige Studien geleitet worden, um das Dienstprogramm von Niveaus DD-cfDNA festzustellen, identifiziert unter Verwendung bekannten Spender-spezifischen SNPs, als lebensfähige Markierung für Ablehnung. In einer solchen Studie wurden 384 Nierenempfänger von 14 klinischen Standorten eingezogen, um Blutproben in zeitlich geplanten Abständen und zuzeiten der klinisch angezeigten Biopsien (31) zur Verfügung zu stellen. Gesamt, konzentrierte sich die Studie auf die Wechselbeziehung zwischen der Gewebelehre in 107 Biopsieexemplaren von 102 Patienten und den Niveaus von DD-cfDNA gefunden in zusammengebrachten Plasmaproben. Im Besonderen wurden 27 Biopsieproben von 27 Patienten mit aktiver Ablehnung zusammen mit 80 Biopsieproben von 75 Patienten ohne aktive Ablehnung erhalten.
In dieser Studie umfasste aktive Ablehnung akute Antikörper-vermittelte Ablehnung (AMR), chronisches Amr und ACR. Die Probe, die in dieser Studie verwendet wurde, setzte eine 1% Abkürzung für den Bruch von DD-cfDNA ein, um das Vorhandensein oder das Fehlen der aktiven Ablehnung anzuzeigen und wurde gefunden, um 85% Besonderheit (95% Ci, 79%-91%) und 59% Empfindlichkeit (95% Ci, 44%-74%) zu haben. Die Empfindlichkeit dieser Probe war für das Absondern zwischen aktivem und abwesendem Amr größer, da der Gebrauch von einer Abkürzung von 1% DD-cfDNA gefunden wurde, um eine 83% Besonderheit (95% Ci, 78%-89%) und 81% Empfindlichkeit (95% Ci, 67%-100%) zu haben. Vornehmlich in beiden Fällen sank die Empfindlichkeit im Wesentlichen, als der Bruch von DD-cfDNA 3% überstieg.
Um Besonderheit und Empfindlichkeit einer nichtinvasiven cfDNA-ansässigen Probe zu verbessern um Ablehnung zu ermitteln Nierenversetzung zu folgen, haben Forscher auch die absolute Menge von DD-cfDNA (32-33) überblickt. Indem es die absolute Menge von DD-cfDNA verhört, kann man die künstlichen Änderungen im Bruch von DD-cfDNA beseitigen wegen der Zunahmen Gesamt-cfDNA Niveaus, die durch Nichtablehnungsereignisse, wie Infektion, Trauma oder Übung verursacht werden und eine genauere Probe möglicherweise schaffen.
Um diese Möglichkeit nachzuforschen, setzte eine Studie 32 informative Kopienzahlvarianten (CNVs) ein, das auf Bevölkerungsfrequenzen, im Gegensatz zu relativen Anteilen Spender- und Empfänger SNPs an gegebenen Orten (32) basierte. Alles CNVs, das innerhalb des Genoms einer Empfängers aber nicht vorhanden sind, Geschenk innerhalb des extrahierten cfDNA wurden deshalb angenommen, um DD-cfDNA darzustellen.
Interessant während die Besonderheit und die Empfindlichkeit insgesamt mit dem Gebrauch von absoluten Niveaus DD-cfDNA verbesserten, hatte diese Probe auch eine größere Kapazität, zwischen dem Vorhandensein und dem Fehlen aktiven Amrs, im Gegensatz zu Fällen aktiven ACR zu unterscheiden. Darüber hinaus waren Serumkreatininniveaus nicht beim Absondern zwischen aktiver Ablehnung und der Ruhe genügend, wahrscheinlich, weil sie von der knäuelförmigen Funktion im Gegensatz zu Nierengewebeschaden (31-33) hinweisender ist.
Eine andere Studie erforschte die absoluten Niveaus von DD-cfDNA in den Nierentransplantationsempfängern, die auf Niveaus von Tacrolimen, ein Immunosuppressant (33) bezogen wurden. Hier fanden die Forscher, dass die absolute Menge von DD-cfDNA bei Patienten mit niedrigeren Tacrolimen planiert im Wesentlichen höher war (<8> Labors auch haben Alternativen zu WGS vorgeschlagen. Unser Gruppe erforschtes gerichtetes Der Reihe nach ordnen von 124 in hohem Grade polymorphes (geringe Allelfrequenz [MAF] >0.4) SNPs unter Verwendung einer handelsüblichen Platte, zukünftiges Der Reihe nach ordnen und ein neuer Algorithmus (34). Diese Annäherung verringerte erheblich die Gesamtmenge des Der Reihe nach ordnens von erforderlichen, abnehmenden Kosten und von Probenzeit und Ermöglichen der schnellen Analyse. Jedoch da diese Probe auf Unterschiede bezüglich MAF zwischen Einzelpersonen baut, würde sie nicht für eng verwandte Spenderempfängerpaare robust sein, wie gesehen in der leben-bedingten Nierenspende. Sie bleibt, für die Entdeckung von mäßigen oder größeren Ablehnungsereignissen validiert zu werden.
Labors auch haben unter Verwendung polymorphen SNPs erforscht, um DD-cfDNA quantitativ zu bestimmen, das mit der Technologie digitalen Tröpfchen PCR (30,35-37) kombiniert wird. Unter Verwendung 41 in hohem Grade polymorphes SNPs, zeigten stabile Niere und HT-Empfänger Brüche DD-cfDNA von 2%-3% mit den stabilen Lebertransplantationsempfängern, die ein Niveau von 7% (35) haben.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
Der Gebrauch von einer teuren und Invasionsgewebebiopsie, Allograftablehnung zu ermitteln hat bedeutende Beschränkungen. Als solches stellt eine minimal Invasionsprobe, die kann die Gesundheit des gesamten verpflanzten Organs direkt und genau festsetzen, ein Heiliges Gral in der festen Organtransplantation dar.
Der Gebrauch von cfDNA, nachdem Versetzung irgendein Anfangsversprechen gezeigt hat, aber studieren weiter und Bestätigung wird angefordert, um unser Verständnis der grundlegenden Biologie von cfDNA sowie seiner Verhaltennachtransplantation zu verbessern. Diesmal ist es klar, dass wichtige Organ-spezifische Unterschiede existieren, und Muster möglicherweise von cfDNA Freigabe unterscheiden auch sich abhängig von der Art des Ablehnungsereignisses. Jedoch stellt cfDNA ein der viel versprechendsten Technologien dennoch entwickelt, um die Gewebebiopsie ergäzunzen oder sogar schließlich zu ersetzen dar.